Перейти к содержанию

Транскриптомные технологии

Добавить ссылки
Материал из Мегавики — свободной энциклопедии
Данная страница не проверялась участниками с соответствующими правами.

Транскрипто́мные техноло́гии (англ. transcriptomics technologies) — методы, разработанные для изучения транскриптома (то есть совокупности всех РНК-транскриптов) организма. В состав транскриптома входят все транскрипты, которые присутствовали в клетке на момент выделения РНК[англ.]. Исследуя транскриптом, можно установить, какие клеточные процессы были активны в тот или иной момент времени.

Первые попытки изучения транскриптома были предприняты в начале 1990-х годов. Благодаря развитию новых технологий в конце 1990-х транскриптомика стала важной биологической наукой. В настоящий момент в транскриптомике есть два основополагающих метода: микрочипы, позволяющие выявить наличие и количество определённых транскриптов, и секвенирование РНК (РНК-Seq), в котором используются методы секвенирования нового поколения для получения последовательностей всех транскриптов. С улучшением методик количество данных, получаемых в ходе одного транскриптомного эксперимента, увеличивалось. В связи с этим методы анализа данных также совершенствовались, чтобы обеспечить точный и эффективный анализ возрастающего объёма данных. Транскриптомные базы данных постоянно растут и становятся всё более полезными для исследователей. Это связано с тем, что правильная интерпретация данных, полученных в ходе транскриптомного эксперимента, практически невозможна без опоры на предшествующие исследования.

Измерение уровня экспрессии определённых генов в клетках разных тканей и при разных условиях или же в разные моменты времени даёт информацию о регуляторных механизмах, связанных с экспрессией генов. С помощью этих данных могут быть определены функции ранее не аннотированных[англ.] генов. Анализ транскриптомов позволяет выявить различия в экспрессии определённых генов у разных организмов, что может быть особенно полезно для понимания молекулярных основ заболеваний человека.

История[править]

Количество публикаций, касающихся РНК-Seq (чёрный), микрочипов (красный), экспрессируемых меток последовательностей (синий) и сериального/кэпового анализа экспрессии генов (жёлтый) с 1990 года по 2016 год[1]

Первая попытка получения части человеческого транскриптома была предпринята в 1991 году; в ходе этого исследования были получены последовательности 609 мРНК из мозга человека[2]. В 2008 году были опубликованы два человеческих транскриптома, состоящие из миллионов последовательностей, происходящих от транскриптов 16 тысяч генов[3][4]. К 2015 году были опубликованы транскриптомы сотен людей[5][6]. Получение транскриптомов индивидуумов с тем или иным заболеванием, разных тканей и даже одиночных клеток в настоящее время является рутинной процедурой[6][7]. Бурное развитие транскриптомики было возможно благодаря быстрому развитию новых экономичных технологий с повышенной чувствительностью[8][9][10][11].

До транскриптомики[править]

Исследования отдельных транскриптов проводились ещё за несколько десятилетий до того, как методы транскриптомики стали общедоступны. В конце 1970-х были получены библиотеки РНК[англ.], которые были конвертированы в комплементарную ДНК (кДНК) с помощью обратной транскриптазы для бабочки Antheraea polyphemus[англ.][12]. В 1980-х с помощью низкопроизводительного секвенирования по Сэнгеру были получены последовательности случайных транскриптов; так появились так называемые экспрессируемые метки последовательностей[англ.] (англ. expressed sequence tags, EST)[2][13][14]. Метод секвенирования по Сэнгеру доминировал до появления технологий высокопроизводительного секвенирования, например, секвенирования синтезом (Solexa/Illumina). EST стали активно использоваться в 1990-х как эффективный метод определения генного состава организма без полногеномного секвенирования[англ.][14]. Количество отдельных транскриптов оценивалось с помощью нозерн-блотов, обратных нозерн-блотов[англ.] и количественной ПЦР с обратной транскрипцией (RT-qPCR)[15][16]. Однако эти методы очень трудоёмки и охватывают лишь крошечную долю целого транскриптома[11].

Первые попытки[править]

Слово «транскриптом» (англ. transcriptome) было введено в употребление в 1990-х годах[17][18]. В 1995 году появился первый транскриптомный метод, основанный на секвенировании, — сериальный анализ экспрессии генов[англ.] (англ. serial analysis of gene expression (SAGE)), который заключался в секвенировании по Сэнгеру соединённых фрагментов случайных транскриптов. Количество транскриптов оценивалось по числу совпадений с фрагментами известных генов[19]. Вскоре появился вариант SAGE, использующий вместо секвенирования по Сэнгеру технологии секвенирования нового поколения — цифровой анализ экспрессии генов (англ. digital gene expression analysis)[8][20]. Однако эти методы практически полностью были вытеснены методами высокопроизводительного секвенирования целых транскриптов, которые давали дополнительную информацию о транскрипте, например, сведения о сплайсинговых вариантах[8].

Развитие современных методов[править]

Сравнение современных методов[21][22][9]
РНК-Seq Микрочипы
Производительность[англ.] От 1 дня до 1 недели на эксперимент[9] 1—2 дня на эксперимент[9]
Необходимое количество РНК Низкое ~ 1 нг тотальной РНК[23] Высокое ~ 1 мкг РНК[24]
Трудоёмкость Высокая (пробоподготовка и анализ данных)[9][21] Низкая[9][21]
Предшествующая информация Не требуется, хотя наличие референсного генома[англ.]/транскриптома упрощает работу[21] Для создания проб[англ.] необходим референсный геном/транскриптом[21]
Точность количественной оценки[англ.]* ~ 90 % (ограничена покрытием[англ.] последовательностей)[25] > 90 % (ограничена точностью детекции флуоресценции)[25]
Разрешение последовательностей Может детектировать однонуклеотидные полиморфизмы и сплайсинговые варианты (ограничение — точность секвенирования (~ 99 %))[25] Специализированные микрочипы могут детектировать сплайсинговые варианты (ограничения — создание проб и кросс-гибридизация)[25]
Чувствительность 1 транскрипт на миллион (приблизительно, ограничение — покрытие последовательности)[25] 1 транскрипт на тысячу (приблизительно, ограничено детекцией флуоресценции)[25]
Динамический диапазон 100000 : 1 (ограничен покрытием последовательности)[26] 1000 : 1 (ограничен насыщением флуоресценции)[26]
Техническая воспроизводимость > 99 %[27][28] > 99 %[29][30]

Превалирующие современные методы — микрочипы и РНК-Seq — появились в середине 1990-х и 2000-х соответственно[8][31]. Публикации по микрочипам, которые измеряли относительное содержание определённых транскриптов за счёт их гибридизации с комплементарными пробами, нанесёнными на микрочип, появились в 1995 году[32][33]. Метод микрочипов позволял одновременно исследовать тысячи транскриптов, и за счёт этого позволял снизить стоимость исследования транскриптома в расчёте на ген и сэкономить усилия[34]. До конца 2000-х лучшими методами транскрипционного профилинга были пятновые олигонуклеотидные чипы (англ. spotted oligonucleotide arrays) и микрочипы Affymetrix[англ.] с высокой плотностью[11][31]. В течение этого периода было создано множество чипов, покрывающих известные гены модельных и экономически важных организмов. Улучшения технологий создания микрочипов привели к увеличению специфичности проб и количества генов, которые можно проанализировать с помощью одного чипа. Благодаря новым методам детекции флуоресценции стало возможным точно определять наличие и количество даже транскриптов, синтезируемых на низком уровне[33][35].

РНК-Seq подразумевает секвенирование кДНК, соответствующей транскриптам, причём численность отдельных фрагментов кДНК определяется численностью соответствующих транскриптов. Огромное влияние на РНК-Seq оказало развитие методов секвенирования нового поколения[8][10]. Первым транскриптомным методом стало масштабное параллельное секвенирование сигнатур[англ.] (англ. Massively parallel signature sequencing (MPSS)), в основе которого лежало образование коротких последовательностей длиной от 16 до 20 пар оснований (п. о.) в ходе сложной последовательности гибридизаций[36]. В 2004 году с помощью этого метода была оценена экспрессия 10 тысяч генов растения Arabidopsis thaliana[37]. Первая работа, посвящённая РНК-Seq, была опубликована в 2006 году. В ходе этого исследования с помощью технологии 454 Life Sciences[англ.] была определена последовательность ста тысяч транскриптов[38]. Полученного покрытия было достаточно для оценки относительного количества отдельных транскриптов. Популярность РНК-Seq значительно повысилась после 2008 года, когда технологии Illumina/Solexa позволили секвенировать один миллиард транскриптов[4][9][39][40]. Благодаря этим данным сейчас возможно количественно оценивать и сравнивать транскриптомы разных людей[4].

Получение данных[править]

Получение данных о транскриптах возможно двумя принципиально различающимися путями: секвенированием отдельных транскриптов (EST или РНК-Seq) или гибридизацией транскриптов на упорядоченный чип нуклеотидных последовательностей (микрочип)[21].

Выделение РНК[править]

Для всех транскриптомных методов необходимо выделить РНК из исследуемого организма. Несмотря на огромное разнообразие биологических систем, методика выделения РНК во всех случаях примерно одна и та же. Она включает разрушение клеток и тканей, разрушение РНКаз при помощи хаотропных[англ.] солей[41], разрушение макромолекул и комплексов, содержащих нуклеотиды, отделение РНК от ненужных биомолекул, включая ДНК, концентрирование РНК при помощи преципитации этанолом[англ.] из раствора и очищение с помощью специальных колонок[англ.][41][42]. Выделенную РНК также можно дополнительно обработать ДНКазой, чтобы разрушить остатки ДНК[43]. Обычно необходимо концентрирование мРНК, поскольку 98 % выделенной РНК приходится на рРНК[44]. Концентрирование можно произвести с помощью методов, использующих наличие у мРНК поли(А)-хвоста, или путём удаления рРНК с помощью специфических проб[45]. На результаты эксперимента может повлиять разрушенная РНК. Например, если отбирать мРНК из повреждённых РНК, то отобранные молекулы могут быть лишены 5'-концов и привести к искажению данных. Чтобы избежать разрушения РНК, перед её выделением образец обычно подвергают быстрому замораживанию[англ.][42].

Экспрессируемые метки последовательностей[править]

Экспрессируемые метки последовательностей (EST) — это короткие нуклеотидные последовательности, полученные из целого транскрипта. Поскольку EST можно получить без какой-либо специфики относительно организма, из которого выделена РНК, их можно получить из смеси организмов или образцов, взятых из окружающей среды[14]. Хотя в настоящее время чаще всего используется высокопроизводительное секвенирование, библиотеки[англ.] EST активно использовали при разработке первых микрочипов. Например, микрочип ячменя был получен из 350 тысяч предварительно секвенированных EST[46].

Сериальный и кэповый анализ экспрессии генов (SAGE/CAGE)[править]

Схема SAGE. Из организма выделяется мРНК, переводится в двуцепочечную ДНК (синий) посредством обратной транскрипции. Далее ДНК расщепляется рестриктазами (в точках ‘X’ и ‘X’+11) с образованием 11-нуклеотидных меток. Далее они конкатенируются и секвенируются с помощью метода Сэнгера с длинными прочтениями (метки разных оттенков синего соответствуют разным генам). Далее последовательности подвергают деконволюции и определяют частоту встречаемости каждой метки. Частота метки свидетельствует об интенсивности экспрессии соответствующего гена[47]

Сериальный анализ экспрессии генов является дальнейшим развитием технологии EST с большей выработкой меток. Он также позволяет провести некоторый количественный анализ численности транскриптов. РНК сначала переводится в кДНК, затем она разрезается на метки длиной 11 нуклеотидов с помощью рестриктаз, которые вносят разрывы в определённые последовательности ДНК. Полученные метки сшивают по типу «голова к хвосту» в длинные фрагменты длиной более 500 нуклеотидов, которые секвенируют с помощью низкопроизводительных, но дающих длинные прочтения[англ.] методов, таких как секвенирование по Сэнгеру. Далее последовательности снова делят на 11-нуклеотидные кусочки с помощью специальных компьютерных программ (деконволюция)[19]. Если референсный геном недоступен, то полученные метки можно непосредственно использовать в качестве диагностических маркеров, которые в случае болезни экспрессируются иначе, чем в здоровом организме[19].

Кэповый анализ экспрессии генов (англ. cap analysis gene expression, CAGE) представляет собой вариант SAGE, при котором в качестве меток берутся только 5'-концевые последовательности мРНК. Поэтому, когда метки выравниваются на референсный геном, можно идентифицировать точки начала транскрипции генов. Этот метод активно используется для анализа промоторов и для клонирования полноразмерных кДНК[48].

SAGE и CAGE дают информацию о большем количестве генов, чем секвенирование отдельных EST, однако пробоподготовка и анализ данных в этих методах существенно сложнее[48].

Микрочипы[править]

Схема работы микрочипов. Из организма выделяется зрелая мРНК (красный) и путём обратной транскрипции переводится в двуцепочечную ДНК (синий). Далее ДНК фрагментируется и флуоресцентно метится (оранжевый). Меченые фрагменты связываются с комплементарными олигонуклеотидными пробами на микрочипе, и интенсивность флуоресценции в каждой ячейке свидетельствует о численности соответствующего гена[47]

Принципы и преимущества[править]

Микрочип состоит из коротких олигонуклеотидов (проб), которые прикреплены в ячейках сетки на стеклянной подложке[49]. Многочисленность транскриптов определяется на основании гибридизации флуоресцентно меченных[англ.] транскриптов с этими пробами[50]. Интенсивность флуоресценции[англ.] в каждой ячейке свидетельствует о численности транскрипта, гибридизующегося с данной пробой[50].

Для создания микрочипа необходимо знать, хотя бы частично, геном исследуемого организма, например, в виде аннотированной последовательности или библиотеки EST; это необходимо для создания проб[34].

Методы[править]

Микрочипы, использующиеся в транскриптомике, можно подразделить на два типа: пятновые чипы с низкой плотностью и чипы высокой плотности с короткими пробами[34]. Пятновые чипы низкой плотности обычно представляют собой стеклянную основу, на которую нанесены пиколитровые капли, содержащие разные фрагменты очищенной кДНК[51]. Эти пробы длиннее, чем в чипах с короткими пробами, и с их помощью нельзя выявить события альтернативного сплайсинга. В пятновых чипах используются два типа флуорофоров, которыми метят экспериментальные и контрольные образцы, а относительная многочисленность высчитывается из интенсивности флуоресценции[52]. Чипы высокой плотности используют только одну флуоресцентную метку, и каждый образец гибридизуется и детектируется отдельно[53]. Чипы высокой плотности распространялись компанией Affymetrix GeneChip. В этих чипах каждому транскрипту соответствует несколько 25-нуклеотидных проб[54]. Компания NimbleGen производит чипы высокой плотности при помощи безмасковой литографии[англ.], которая позволяла получать чипы разного строения. Один чип содержит сотни тысяч проб длиной от 45 до 85 нуклеотидов, которые гибридизуются с образцом, меченным флуоресцентной меткой одного вида[55].

РНК-Seq[править]

Схема РНК-Seq. Из организма выделяется зрелая мРНК (красный) и путём обратной транскрипции переводится в двуцепочечную ДНК (синий). ДНК секвенируется при помощи высокопроизводительных методов с короткими прочтениями. Далее прочтения выравниваются на референсный геном, благодаря чему выявляются транскрибирующиеся участки генома. С помощью полученных данных можно установить, какие гены экспрессируются, какова интенсивность их экспрессии, а также наличие альтернативного сплайсинга[47]

Принципы и преимущества[править]

РНК-Seq представляет собой сочетание высокопроизводительного секвенирования с вычислительными методами оценки численности отдельных транскриптов в экстракте РНК[9]. Обычно получаются последовательности длиной около 100 пар оснований (п. о.), однако в зависимости от метода секвенирования их длина может составлять от 30 п. о. до 10 тысяч п. о. РНК-Seq обеспечивает глубокое покрытие транскриптома множеством коротких фрагментов, благодаря которому возможно при помощи вычислительных методов реконструировать исходные транскрипты, выравнивая прочтения на референсный геном или друг на друга (сборка de novo)[8]. С помощью РНК-Seq можно рассчитать количество как многочисленных, так и малочисленных РНК, так как динамический диапазон метода составляет 5 порядков. В этом заключается главное преимущество РНК-Seq перед микрочипами. Кроме того, для РНК-Seq требуется очень мало исследуемой РНК по сравнению с микрочипами — нанограммы против микрограммов. Благодаря этому РНК-Seq в сочетании с линейной амплификацией кДНК позволяет исследовать очень небольшие клеточные структуры вплоть до отдельных клеток[23][56]. Теоретически верхнего предела количественной оценки в РНК-Seq не существует, и для прочтений длиной 100 п. о. фоновый шум в неповторяющихся участках очень низок[9].

С помощью РНК-Seq можно идентифицировать гены в геноме или установить, какие гены активны в данный момент времени. На основании количества прочтений можно точно установить относительный уровень экспрессии генов. Методология РНК-Seq постоянно совершенствуется, преимущественно за счёт улучшения технологий секвенирования, которые повышают производительность и точность метода, а также выдают прочтения всё большей длины[57]. Со времени первых публикаций в 2006 и 2008 годах[38][58] РНК-Seq интенсивно внедрялся в исследования и к 2015 году догнал микрочипы, став вторым доминирующим транскриптомным методом[59].

Попытки получения транскриптомных данных для отдельных клеток стимулировали совершенствование методов приготовления библиотек для РНК-Seq, что значительно увеличило чувствительность технологии. На данный момент получен ряд транскриптомов единичных клеток и даже появились методы РНК-Seq in situ, в которых транскриптомы отдельных клеток были получены непосредственно в фиксированных тканях[60].

Методы[править]

РНК-Seq появился вместе с бурным развитием нескольких методов высокопроизводительного секвенирования[61]. Однако стадии секвенирования выделенных РНК предшествуют несколько этапов пробоподготовки, которые различаются в разных методах. Методы различаются способами концентрирования транскриптов, фрагментации, амплификации, способом секвенирования (одноконцевое или парноконцевое), а также тем, сохраняется ли информация об исходной цепи[61].

Чувствительность РНК-Seq в конкретном эксперименте можно повысить за счёт концентрирования интересующих классов РНК и удаления остальных. мРНК можно отделить с помощью олигонуклеотидных проб, которые связываются с их поли(А)-хвостами. Удалить неинформативные и чрезвычайно многочисленные рРНК можно с помощью гибридизующихся проб, созданных специально для рРНК данного таксона (например, млекопитающих или растений). Однако вместе с рРНК с помощью такого подхода можно удалить и другие РНК, что может исказить картину эксперимента. Малые РНК, например, микроРНК, можно выделить на основании их размера из агарозного геля после электрофореза[англ.][62].

Поскольку мРНК, как правило, длиннее, чем единичные прочтения в большинстве методов высокопроизводительного секвенирования, обычно перед секвенированием транскрипты фрагментируют[англ.][63]. Метод фрагментации лежит в основе создания библиотеки для секвенирования. Фрагментацию можно проводить путём химического гидролиза, распыления, обработки ультразвуком (соникации[англ.]) или обратной транскрипции с использованием терминирующих нуклеотидов[63]. Кроме того, фрагментацию и добавление меток к кДНК можно осуществить одновременно при помощи транспозаз[64].

В ходе пробоподготовки для секвенирования фрагменты кДНК, соответствующие транскриптам, можно размножить с помощью ПЦР так, чтобы повысить численность молекул, содержащих необходимые 3'- и 5'-концевые адаптеры[англ.][65]. Стадия амплификации также необходима перед секвенированием образцов с очень низким содержанием РНК. Нижним пределом количества РНК, которое пригодно для секвенирования, является 50 пикограмм[66]. Чтобы оценить качество библиотеки и секвенирования (GC-состав, длина фрагментов, предпочтение фрагментов с определённым положением в транскрипте), можно использовать контрольные РНК-spike in[англ.][67]. Уникальные идентификаторы молекул[англ.] (англ. unique molecular identifiers, UMI) — это короткие случайные последовательности, которые используются для индивидуального мечения фрагментов при приготовлении библиотеки таким образом, чтобы после добавления идентификатора каждый фрагмент был уникален[68]. С помощью UMI можно измерить численность транскриптов в абсолютной шкале, чтобы скорректировать отклонения, возникшие при создании библиотеки, перед амплификацией, а также чтобы точно оценить количество ДНК в исходном образце. UMI особенно удобны для РНК-Seq одиночных клеток, в которых исходное количество РНК очень мало и требует неспецифичной амплификации[69][70][71].

После пробоподготовки молекулы транскриптов (точнее, соответствующих им кДНК) можно секвенировать в одном направлении (одноконцевое прочтение) или в обоих (парноконцевое прочтение). Одноконцевое секвенирование, как правило, быстрее и дешевле, и в большинстве случаев его достаточно для количественной оценки уровней экспрессии генов. Парноконцевое секвенирование позволяет получить более точные выравнивания и сборки, что очень важно для аннотации генов и описания изоформ транскриптов[9]. Методы РНК-Seq, специфичные по отношению к цепи, сохраняют сведения о цепи ДНК, с которой был транскрибирован каждый транскрипт. Без этой информации прочтения можно выровнять на локус, однако будет неясно, в каком направлении происходит транскрипция гена. Одноцепочечный РНК-Seq удобен для определения направления транскрипции перекрывающихся генов[англ.], расположенных на разных цепях, что позволяет сделать предсказание генов у немодельных организмов более точным[72].

Технологии секвенирования, используемые в РНК-Seq[73][74]
Платформа Коммерческий релиз Типичная длина прочтения Максимальная производительность одного запуска Точность единичного прочтения Запуски РНК-Seq, размещённые в базе NCBI SRA по состоянию на октябрь 2016 года. RNA-Seq runs deposited in the NCBI SRA (Oct 2016)[75]
454 Life Sciences 2005 700 п. о. 0,7 миллиарда п. о. 99,9 % 3548
Illumina 2006 50-300 п. о. 900 миллиардов п. о. 99,9 % 362903
SOLiD 2008 50 п. о. 320 миллиардов п. о. 99,9 % 7032
Ion Torrent 2010 400 п. о. 30 миллиардов п. о. 98 % 1953
PacBio[англ.] 2011 10000 п. о. 2 миллиарда п. о. 87 % 160

NCBI SRA — архив прочтений последовательностей[англ.] Национального центра биотехнологической информации (США)

Поскольку в настоящий момент РНК-Seq включает перевод РНК в кДНК в ходе обратной транскрипции, платформы для последующего секвенирования одинаковы и для транскриптомных, и для геномных данных. По этой причине развитие РНК-Seq в значительной мере определяется усовершенствованием методов секвенирования ДНК[74][76][77]. Однако всё большее распространение получает непосредственное секвенирование РНК при помощи нанопор[78][79]. С помощью нанопорового секвенирования в РНК можно обнаружить модифицированные основания, которые нельзя было выявить при секвенировании кДНК, кроме того, для этого метода не нужна амплификация, которая вносит дополнительные искажения[10][80].

Чувствительность и точность РНК-Seq определяются числом прочтений, полученных с каждого образца[81][82]. Для достаточного покрытия транскриптома необходимо очень много прочтений, что позволяет обнаружить даже малочисленные транскрипты. Дополнительные сложности создаёт этап секвенирования, дающего прочтения ограниченной длины, различной точности и качества. Более того, организмы каждого вида имеют разное количество генов, поэтому для эффективной сборки транскриптома для каждого вида необходимо разное число прочтений. На ранних этапах это количество определялось эмпирически, однако с развитием технологий необходимое покрытие стало возможным предсказывать вычислительными методами. Наиболее эффективным способом улучшения точности выявления дифференциальной экспрессии низкоэкспрессируемых генов является не увеличение числа прочтений, а увеличение копий[англ.][83]. В настоящий момент Энциклопедия элементов ДНК рекомендует 70-кратное покрытие экзома для обычного РНК-Seq и до 500-кратного покрытия для обнаружения редких транскриптов и изоформ[84][85][86].

Анализ данных[править]

Методы транскриптомики позволяют проводить параллельные эксперименты со множеством образцов, поэтому для получения результатов как с помощью РНК-Seq, так и с помощью микрочипов необходима серьёзная обработка данных[англ.] вычислительными методами[87][88][89][90]. Данные с микрочипов представляют собой изображения с высоким разрешением, поэтому обработка данных включает выявление свойств[англ.] (англ. feature detection) и спектральный анализ[91]. Изображения, полученные с микрочипов, достигают размера 750 Мб, в то время как обработанные данные занимают 60 Мб. Множество коротких проб, соответствующих одному и тому же транскрипту, могут позволить определить экзон-интронную структуру гена, поэтому для определения достоверности финального сигнала необходимы статистические модели. В ходе экспериментов РНК-Seq получаются миллиарды коротких последовательностей ДНК, которые необходимо выровнять на референсный геном, включающий миллионы или миллиарды п. о. Сборка транскриптома de novo требует построения весьма сложных графов последовательностей[англ.][92]. Операции обработки данных РНК-Seq требуют многократного повторения, поэтому для них могут удобны параллелизованные вычисления, однако с использованием современных алгоритмов обработку данных простых транскриптомных экспериментов, не требующих сборки de novo, можно осуществить даже на обычном персональном компьютере[93]. Человеческий транскриптом можно достаточно точно собрать из 300 миллионов 100-нуклеотидных прочтений, полученных с помощью РНК-Seq[81][82]. Для хранения такого объёма данных в сжатом формате FASTQ[англ.] требуется 1,8 Гб дискового пространства на образец. Обработанные численные значения для каждого гена занимают ещё меньше памяти, сопоставимо с обработанными данными с микрочипов. Данные о последовательностях можно хранить в публичных данных, таких как SRA (от англ. sequence read archive — архив прочтений последовательностей)[94]. Набор данных РНК-Seq можно загрузить в базу данных Gene Expression Omnibus[95].

Обработка изображений[править]

Микрочип и проточная ячейка для секвенирования (РНК-Seq). Обработка изображений при использовании микрочипов и РНК-Seq различается. В микрочипе каждое пятно соответствует определённой олигонуклеотидной пробе, и интенсивность флуоресценции соответствует численности определённого транскрипта (Affymetrix). В ячейке для высокопроизводительного секвенирования пятно соответствует одному нуклеотиду, секвенированному в данный момент времени, и цвет флуоресценции соответствует виду нуклеотида (Illumina Hiseq). В различных видах этих методов может быть использовано большее или меньшее количество цветов[47][96]

Обработка изображений, полученных с микрочипов, должна сохранять регулярную сеть[англ.] ячеек изображения и независимо количественно оценивать интенсивность флуоресценции в каждой ячейке. Необходимо также выявлять артефакты изображений[англ.] и исключать их из финального анализа. Интенсивность флуоресценции свидетельствует о представленности каждой последовательности, поскольку последовательность пробы в каждой ячейке известна[96].

Первые этапы РНК-Seq также включают схожую обработку изображений, однако перевод изображений в данные о последовательностях производится автоматически специальными программами. Результатом секвенирования синтезом по технологии Illumina является совокупность кластеров, расположенных на поверхности проточной ячейки[97]. В ходе каждого цикла секвенирования изображение каждой проточной ячейки снимается до четырёх раз, причём один запуск включает десятки или сотни циклов. Кластеры проточных ячеек аналогичны пятнам в микрочипах и на ранних этапах секвенирования должны быть правильно определены. При пиросеквенировании (компания Roche[англ.]) интенсивность испускаемого света соответствует количеству одинаковых нуклеотидов в гомополимерном участке. Существует множество вариаций перечисленных методов, и каждая предполагает использование разных профилей ошибок для получающихся данных[98].

Анализ данных РНК-Seq[править]

В ходе экспериментов РНК-Seq получается огромный объём прочтений, которые необходимо обработать для получения полезной информации. Анализ данных, как правило, включает использование комбинаций различных биоинформатических программ, которые необходимо подбирать сообразно эксперименту и целям. Процесс обработки данных можно разбить на четыре этапа: контроль качества, выравнивание, количественный анализ и дифференциальная экспрессия[99]. Наиболее популярные программы для обработки данных РНК-Seq запускаются из командной строки в среде Unix или R/Bioconductor[89].

Контроль качества[править]

Прочтения небезупречны, поэтому необходимо определить точность прочтения каждого основания в последовательности. Прочтения, прошедшие контроль качества, гарантированно имеют высокую точность определения каждого основания, их GC-состав соответствует ожидаемому распределению, в них нет перепредставленности коротких мотивов и редки дупликации[82] . Существует несколько программ для анализа качества, например, FastQC и FaQCs. Низкокачественные прочтения или удаляются, или специальным образом помечаются, что учитывается при дальнейшем анализе[100][101].

Выравнивание[править]

Чтобы связать численность прочтений с определённым геном, прочтения необходимо выровнять на референсный геном или друг на друга, если референсный геном неизвестен (сборка транскриптома de novo)[102][103]. Основными требованиями, которым должны удовлетворять программы для выравнивания, являются скорость, позволяющая за приемлемое время выровнять миллиарды коротких прочтений, определённая гибкость, чтобы выявлять случаи сплайсинга эукариотических мРНК, а также правильно выбирать расположение прочтений, соответствующих нескольким местам в геноме. Программы постоянно совершенствуются в соответствии с перечисленными требованиями, а увеличение длины прочтений снижает вероятность неоднозначного выравнивания. Европейский институт биоинформатики[англ.] (EBI) поддерживает список доступных в данный момент инструментов для выравнивания прочтений, полученных при высокопроизводительном секвенировании[104].

Выравнивание первичных эукариотических транскриптов на референсный геном требует особое обращение с интронами, которых нет в зрелых мРНК[105]. Программы для выравнивания коротких прочтений могут создавать особые выравнивания, предназначенные специально для идентификации сайтов сплайсинга на основе канонических последовательностей сайтов сплайсинга. Идентификация сайтов сплайсинга предотвращает их ошибочное выравнивание или отбраковывание, позволяя выровнять на референсный геном большее количество прочтений и увеличивая качество количественных оценок экспрессии генов. Поскольку регуляция экспрессии генов[англ.]* может осуществляться на уровне изоформ мРНК, выравнивания, учитывающие сплайсинг, позволяют обнаружить изменения в численности тех или иных изоформ, что было бы невозможно с помощью обычного анализа[106].

Для сборки транскриптома de novo производится выравнивание прочтений друг на друга, что позволяет реконструировать полноразмерные транскрипты без использования референсного генома[107]. Сложностями сборки de novo являются необходимость больших вычислительных мощностей, чем для сборки на основе референсного генома, дополнительной проверки вариантов и фрагментов генов и дополнительной аннотации собранных транскриптов. Первые метрики, предназначенные для оценки качества сборки транскриптома, такие как N50, были признаны ошибочными[108], и в данный момент доступны усовершенствованные методы оценки. Метрики, основанные на аннотации, хорошо подходят для оценки степени сборки генома. Транскриптом, собранный de novo, может быть использован в качестве референсного при выравнивании последовательностей и количественном анализе экспрессии генов[109][110].

Программы для сборки транскриптома de novo
Программа Дата релиза Дата последнего обновления Вычислительная эффективность Сильные и слабые стороны
Velvet-Oases[111][112] 2008 2011 Низкая, один поток выполнения, необходимо много памяти с произвольным доступом Первый сборщик коротких прочтений. В настоящее время почти не используется.
SOAPdenovo-trans[103] 2011 2014 Средняя, несколько потоков выполнения, умеренная необходимость в памяти с произвольным доступом Один из первых сборщиков коротких прочтений. Адаптирован для сборки транскриптомов.
Trans-ABySS[113] 2010 2016 Средняя, несколько потоков выполнения, умеренная необходимость в памяти с произвольным доступом Предназначена для коротких прочтений, но может быть использована и для сложных транскриптомов. Доступна MPI-параллельная версия для вычислительных кластеров.
Trinity[114][92] 2011 2017 Средняя, несколько потоков выполнения, умеренная необходимость в памяти с произвольным доступом Предназначена для коротких прочтений. Можно использовать для сложных транскриптомов, но требуется много памяти.
miraEST[115] 1999 2016 Средняя, несколько потоков выполнения, умеренная необходимость в памяти с произвольным доступом Может обрабатывать повторяющиеся последовательности, комбинирует несколько форматов данных секвенирования, совместима с большим числом платформ секвенирования.
Newbler[116] 2004 2012 Низкая, один поток выполнения, необходимо много памяти с произвольным доступом Специализирована на устранении ошибок секвенаторов 454 Roche, связанных с гомополимерными последовательностями.
CLC genomics workbench[117] 2008 2014 Высокая, несколько потоков выполнения, низкая необходимость памяти с произвольным доступом Имеет графический интерфейс, может комбинировать различные технологии секвенирования. Не специализирована для транскриптомов, перед использованием необходимо приобрести лицензию.
SPAdes[118] 2012 2017 Высокая, несколько потоков выполнения, низкая необходимость памяти с произвольным доступом Предназначена для транскриптомных экспериментов с единичными клетками.
RSEM[119] 2011 2017 Высокая, несколько потоков выполнения, низкая необходимость памяти с произвольным доступом Может оценивать частоту альтернативно сплайсированных транскриптов. Удобна в использовании.
StringTie[93] 2015 2018 Высокая, несколько потоков выполнения, низкая необходимость памяти с произвольным доступом Может использовать комбинацию методов сборки на основе референсного генома и de novo для идентификации транскриптов.

Количественный анализ[править]

Тепловая карта, отображающая наличие одинаковых паттернов экспрессии в различных образцах. Каждая колонка отображает данные измерений изменений экспрессии генов в единичном образце. Относительная экспрессия генов показана цветом: высокая (красный), средняя (белый) и низкая (синий). Гены и образцы с одинаковой экспрессией можно автоматически сгруппировать (левое и верхнее деревья). Образцы могут соответствовать разным индивидуумам, тканям, условиям среды и состоянию здоровья. В данном примере в образцах 1, 2 и 3 экспрессия набора генов 1 высокая, а набора 2 — низкая[47][120]

Количественный анализ выравниваний прочтений может быть произведён на уровне гена, экзона и транскрипта. Типичным результатом анализа является количество прочтений для каждого элемента анализа (гена, экзона или транскрипта). Например, для генов она выдаётся в формате general feature format (GFF). Количество прочтений для генов и экзонов можно определить при помощи разных программ, например, HTSeq[121]. Анализ на уровне транскрипта более сложен и требует привлечения вероятностных методов для оценки численности транскрипта на основании коротких прочтений; например, это может выполнить программа cufflinks[106]. Прочтения, одинаково хорошо ложащиеся на разные места в геноме, должны быть идентифицированы и удалены либо выровнены на одно из возможных мест либо на наиболее вероятное из них. Некоторые методы оценки вовсе не предполагают выравнивания прочтения на референсный геном. Например, метод, используемый в программе kallisto, объединяет псевдовыравнивание и количественный анализ в один шаг, который идёт на два порядка быстрее, чем методы программ tophat и cufflinks, и требует меньших вычислительных затрат[122].

Дифференциальная экспрессия[править]

Когда для каждого транскрипта получены количественные данные, с помощью их статистического анализа, моделирования и нормализации анализируется дифференциальная экспрессия генов[102]. Большинство программ, которые её анализируют, берут на вход таблицу из названий генов и числа транскриптов для каждого из них, но некоторые программы, например, cuffdiff, в качестве входных данных получают выравнивание прочтений в формате BAM[англ.] (от англ. Binary Alignment Map — карта попарных выравниваний). На выходе программы выдают список генов с результатами попарных статистических тестов, проверяющих значимость различий в экспрессии между экспериментальными и контрольными данными[123].

Программы для анализа дифференциальной экспрессии генов в экспериментах РНК-Seq
Программа Среда Специализация
Cuffdiff2[102] Основанные на Unix Анализ транскриптов, направленный на обнаружение событий альтернативного сплайсинга мРНК
EdgeR[88] R/Bioconductor Любые количественные геномные данные
DEseq2[124] R/Bioconductor Разные типы данных
Limma/Voom[87] R/Bioconductor Microarray or RNA-Seq data, flexible experiment design
Ballgown[125] R/Bioconductor Эффективное и чувствительное отыскание транскриптов

Подтверждение[править]

Результаты транскриптомного анализа можно подтвердить с помощью других методов, например, количественной ПЦР (qPCR)[126]. Экспрессия генов измеряется относительно стандартной экспрессии изучаемого гена и контрольных генов. Принцип измерения в qPCR такой же, что и в РНК-Seq, а именно, значение для данного гена рассчитывается на основе концентрации участка-мишени в исследуемом образце. Однако qPCR подходит только для ампликонов[англ.], имеющих менее 300 п. о. и расположенных вблизи 3'-конца кодирующей области[127]. Если необходимо проверить данные по изоформам транскрипта, с помощью тщательного анализа выравниваний прочтений РНК-Seq можно определить, каким участкам должны соответствовать праймеры для qPCR, чтобы сделать различия наиболее явными[128]. Измерение экспрессии контрольных генов наряду с исследуемыми даёт стабильные референсные данные. Проверка данных РНК-Seq с помощью контрольной ПЦР показала, что разные варианты РНК-Seq в целом дают схожие данные[58][129][130].

Для анализа транскриптомных данных очень важна информация о функциях изучаемых генов. Наблюдаемые паттерны экспрессии генов можно связать с определённым фенотипом при помощи экспериментов по нокдауну изучаемых генов и синтетическому спасению[англ.][131].

Применение[править]

Диагностика и профилирование заболеваний[править]

Транскриптомные технологии нашли применение в различных областях биомедицины, в частности, в диагностике и профилировании заболеваний[9]. С помощью РНК-Seq стало возможным обнаружение сайтов начала транскрипции, использования альтернативных промоторов и новых вариантов альтернативного сплайсинга. Поскольку геномные регуляторные элементы[англ.] играют важную роль в патогенезе многих заболеваний, определение их вариантов чрезвычайно важно для интерпретации данных полногеномного поиска ассоциаций[132]. С помощью РНК-Seq можно обнаруживать однонуклеотидные полиморфизмы, связанные с болезнями, случаи аллелеспецифичной экспрессии, слияние генов[англ.], которые позволяют пролить свет на генетические основы развития заболеваний[133].

С помощью РНК-Seq можно получить информацию о транскрипции эндогенных ретротранспозонов, которые могут влиять на транскрипцию соседних генов посредством разнообразных эпигенетических механизмов, что может привести к развитию болезней[134]. Важной потенциальной сферой применения РНК-Seq является исследование молекулярных основ нарушений иммунной системы, потому что этот метод позволяет разделить популяции иммунных клеток разных типов и секвенировать репертуары T- и B-клеточных рецепторов пациентов[135][136].

Транскриптомы человека и его патогенов[править]

С помощью РНК-Seq можно находить изменения в экспрессии генов у человеческих патогенов, что может помочь идентифицировать новые факторы вирулентности[англ.], предсказывать устойчивость к антибиотикам, а также понять детали взаимодействия патогена с иммунной системой хозяина[англ.][137][138]. С помощью РНК-Seq можно разработать оптимизированные меры контроля над инфекцией[англ.], а также направленные индивидуальные стратегии лечения[136].

Транскриптомный анализ можно проводить и для хозяина, и для патогена. С помощью двойного РНК-Seq можно одновременно построить профили экспрессии генов и хозяина, и патогена в ходе всего инфекционного процесса. Такой подход позволяет изучать динамический иммунный ответ и межвидовые генные регуляторные сети[англ.] для обоих взаимодействующих организмов с момента начального контакта до инвазии и финальной персистенции патогена или его разрушения иммунной системой хозяина[139][140].

Ответы на условия окружающей среды[править]

Транскриптомика позволяет идентифицировать гены и метаболические пути, ответственные за ответ и противодействие стрессам, связанным с биотическими и абиотическими факторами внешней среды[141][131]. Благодаря неспецифичным методам транскриптомики с её помощью можно находить новые генные сети даже в сложных системах. Например, сравнительный анализ нескольких линий нута на различных стадиях развития позволил идентифицировать транскрипционные профили, связанные со стрессами, вызванными засухой и повышенной солёностью; в частности, была показана роль изоформ транскриптов AP2[англ.]-EREBP[англ.][141]. Изучение экспрессии генов при формировании биоплёнок патогенными дрожжами Candida albicans позволило выявить набор совместно регулируемых генов, критически важных для образования и поддержания биоплёнки[142].

Транскриптомное профилирование даёт ценнейшую информацию о механизмах лекарственной устойчивости. Анализ более тысячи изолятов[англ.] малярийного плазмодия Plasmodium falciparum[143] показал, что устойчивость к артемизинину изолятов из Юго-Восточной Азии связана с повышенной активностью ответа на неуложенные белки[англ.] и с более медленным прохождением внутриэритроцитарной стадии жизненного цикла[144].

Аннотация функций генов[править]

Одно из применений транскриптомных технологий заключается в определении функций генов, а также аллелей, ответственных за конкретный фенотип. Транскриптомика экотипов растения Arabidopsis, которые гипераккумулируют[англ.] металлы, показала связь с этим фенотипом генов, отвечающих за проникновение металлов в организм, толерантность и гомеостаз[145]. Объединение данных РНК-Seq, полученных для разных тканей, позволило усовершенствовать аннотацию функций генов у коммерчески важных организмов, например, огурца[146], или видов, находящихся под угрозой исчезновения, таких как коала[147].

Сборка прочтений РНК-Seq не зависит от референсного генома[114], поэтому этот метод идеально подходит для изучения экспрессии генов у немодельных организмов, для которых ещё нет готовых геномных данных. Например, база данных однонуклеотидных полиморфизмов, которая использовалась в программах по размножению псевдотсуги Мензиса, была создана при транскриптомном анализе de novo при отсутствии секвенированного генома[148]. Схожим образом гены, участвующие в развитии сердечной, мышечной и нервной тканей у омара, были идентифицированы путём сравнения транскриптомов разных тканей без использования последовательности генома. РНК-Seq также можно использовать для обнаружения ранее неизвестных белоккодирующих областей в уже секвенированных геномах[149].

Некодирующие РНК[править]

Обычно транскриптомика рассматривает только мРНК клетки. Однако те же методы можно применить и к некодирующим РНК, которые участвуют в трансляции, репликации геномной ДНК, сплайсинге и регуляции транскрипции[150][151][152][153]. Многие из этих некодирующих тРНК связаны с развитием болезней, в том числе рака, сердечно-сосудистых заболеваний и заболеваний нервной системы[англ.][154].

Базы данных транскриптомов[править]

При изучении транскриптомов создаются огромные объёмы данных, которые потенциально могут быть использованы и в других проектах. Поэтому сырые или обработанные данные размещают в публичных базах данных, чтобы сделать их доступными для всего научного сообщества. Например, по состоянию на 2018 год, база данных Gene Expression Omnibus содержит данные миллионов экспериментов[155].

Базы данных транскриптомов
Название Владелец Данные Описание
Gene Expression Omnibus[95] NCBI Микрочипы, РНК-Seq Первая база данных транскриптомов, полученных из разных источников. Первая ввела стандарты MIAME[англ.] и MINSEQE, которые регламентируют необходимые метаданные для эксперимента, чтобы он был хорошо интерпретируем и воспроизводим[156][157].
ArrayExpress[158] ENA[англ.] Микрочипы Импортирует наборы данных из Gene Expression Omnibus и подчиняется ей. Обработанные данные и метаданные экспериментов хранятся в ArrayExpress, а сырые прочтения — в ENA. Соответствует стандартам MIAME и MINSEQE[156][157].
Expression Atlas[англ.][159] EBI Микрочипы, РНК-Seq Содержит данные о тканеспецифичной экспрессии генов у животных и растений. Содержит данные вторичных анализов и их визуализацию, использует термины Gene Ontology, домены InterPro[англ.] и метаболические пути. Содержит ссылки на данные по многочисленности белков, если они имеются.
Genevestigator[англ.][160] Частное курирование Микрочипы, РНК-Seq Содержит справочные пояснения к публично доступным транскриптомным данным, в основном касающиеся медицины и биологии растений. Данные отдельных экспериментов нормализованы, что позволяет сравнивать экспрессию генов в различных экспериментах. Для полного доступа необходимо приобрести лицензию, бесплатно доступна лишь часть базы.
RefEx[161] DDBJ Все Транскриптомы, полученные из 40 различных органов человека, мыши и крысы. Данные по экспрессии генов визуализированы в виде тепловой карты, наложенной на трёхмерную модель анатомической структуры.
NONCODE[162] noncode.org РНК-Seq Некодирующие РНК (кроме тРНК и рРНК)

Примечания[править]

  1. ↑ Medline trend: automated yearly statistics of PubMed results for any query. dan.corlan.net. Дата обращения: 5 октября 2016.
  2. ↑ 2,0 2,1 Sutcliffe J. G., Milner R. J., Bloom F. E., Lerner R. A. Common 82-nucleotide sequence unique to brain RNA. (англ.) // Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. — 1982. — August (vol. 79, no. 16). — P. 4942—4946. — PMID 6956902. [исправить]
  3. ↑ Pan Qun, Shai O., Lee L. J., Frey B. J., Blencowe B. J.  Deep Surveying of Alternative Splicing Complexity in the Human Transcriptome by High-Throughput Sequencing // Nature Genetics. — 2008. — Vol. 40, no. 12. — P. 1413—1415. — doi:10.1038/ng.259. — PMID 18978789. [исправить]
  4. ↑ 4,0 4,1 4,2 Sultan M., Schulz M. H., Richard H., Magen A., Klingenhoff A., Scherf M., Seifert M., Borodina T., Soldatov A., Parkhomchuk D., Schmidt D., O'Keeffe S., Haas S., Vingron M., Lehrach H., Yaspo M. L. A global view of gene activity and alternative splicing by deep sequencing of the human transcriptome. (англ.) // Science (New York, N.Y.). — 2008. — 15 August (vol. 321, no. 5891). — P. 956—960. — doi:10.1126/science.1160342. — PMID 18599741. [исправить]
  5. ↑ Lappalainen T., Sammeth M., Friedländer M. R., 't Hoen P. A., Monlong J., Rivas M. A., Gonzàlez-Porta M., Kurbatova N., Griebel T., Ferreira P. G., Barann M., Wieland T., Greger L., van Iterson M., Almlöf J., Ribeca P., Pulyakhina I., Esser D., Giger T., Tikhonov A., Sultan M., Bertier G., MacArthur D. G., Lek M., Lizano E., Buermans H. P., Padioleau I., Schwarzmayr T., Karlberg O., Ongen H., Kilpinen H., Beltran S., Gut M., Kahlem K., Amstislavskiy V., Stegle O., Pirinen M., Montgomery S. B., Donnelly P., McCarthy M. I., Flicek P., Strom T. M., Lehrach H., Schreiber S., Sudbrak R., Carracedo A., Antonarakis S. E., Häsler R., Syvänen A. C., van Ommen G. J., Brazma A., Meitinger T., Rosenstiel P., Guigó R., Gut I. G., Estivill X., Dermitzakis E. T. Transcriptome and genome sequencing uncovers functional variation in humans. (англ.) // Nature. — 2013. — 26 September (vol. 501, no. 7468). — P. 506—511. — doi:10.1038/nature12531. — PMID 24037378. [исправить]
  6. ↑ 6,0 6,1 Melé M., Ferreira P. G., Reverter F., DeLuca D. S., Monlong J., Sammeth M., Young T. R., Goldmann J. M., Pervouchine D. D., Sullivan T. J., Johnson R., Segrè A. V., Djebali S., Niarchou A., GTEx Consortium., Wright F. A., Lappalainen T., Calvo M., Getz G., Dermitzakis E. T., Ardlie K. G., Guigó R. Human genomics. The human transcriptome across tissues and individuals. (англ.) // Science (New York, N.Y.). — 2015. — 8 May (vol. 348, no. 6235). — P. 660—665. — doi:10.1126/science.aaa0355. — PMID 25954002. [исправить]
  7. ↑ Kolodziejczyk A. A., Kim J. K., Svensson V., Marioni J. C., Teichmann S. A. The technology and biology of single-cell RNA sequencing. (англ.) // Molecular Cell. — 2015. — 21 May (vol. 58, no. 4). — P. 610—620. — doi:10.1016/j.molcel.2015.04.005. — PMID 26000846. [исправить]
  8. ↑ 8,0 8,1 8,2 8,3 8,4 8,5 McGettigan P. A. Transcriptomics in the RNA-seq era. (англ.) // Current Opinion In Chemical Biology. — 2013. — February (vol. 17, no. 1). — P. 4—11. — doi:10.1016/j.cbpa.2012.12.008. — PMID 23290152. [исправить]
  9. ↑ 9,00 9,01 9,02 9,03 9,04 9,05 9,06 9,07 9,08 9,09 9,10 Wang Z., Gerstein M., Snyder M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. (англ.) // Nature Reviews. Genetics. — 2009. — January (vol. 10, no. 1). — P. 57—63. — doi:10.1038/nrg2484. — PMID 19015660. [исправить]
  10. ↑ 10,0 10,1 10,2 Ozsolak F., Milos P. M. RNA sequencing: advances, challenges and opportunities. (англ.) // Nature Reviews. Genetics. — 2011. — February (vol. 12, no. 2). — P. 87—98. — doi:10.1038/nrg2934. — PMID 21191423. [исправить]
  11. ↑ 11,0 11,1 11,2 Morozova O., Hirst M., Marra M. A. Applications of new sequencing technologies for transcriptome analysis. (англ.) // Annual Review Of Genomics And Human Genetics. — 2009. — Vol. 10. — P. 135—151. — doi:10.1146/annurev-genom-082908-145957. — PMID 19715439. [исправить]
  12. ↑ Sim G. K., Kafatos F. C., Jones C. W., Koehler M. D., Efstratiadis A., Maniatis T. Use of a cDNA library for studies on evolution and developmental expression of the chorion multigene families. (англ.) // Cell. — 1979. — December (vol. 18, no. 4). — P. 1303—1316. — PMID 519770. [исправить]
  13. ↑ Putney S. D., Herlihy W. C., Schimmel P. A new troponin T and cDNA clones for 13 different muscle proteins, found by shotgun sequencing. (англ.) // Nature. — 1983. — 21 April (vol. 302, no. 5910). — P. 718—721. — PMID 6687628. [исправить]
  14. ↑ 14,0 14,1 14,2 Marra M. A., Hillier L., Waterston R. H. Expressed sequence tags--ESTablishing bridges between genomes. (англ.) // Trends In Genetics : TIG. — 1998. — January (vol. 14, no. 1). — P. 4—7. — doi:10.1016/S0168-9525(97)01355-3. — PMID 9448457. [исправить]
  15. ↑ Alwine J. C., Kemp D. J., Stark G. R. Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes. (англ.) // Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. — 1977. — December (vol. 74, no. 12). — P. 5350—5354. — PMID 414220. [исправить]
  16. ↑ Becker-André M., Hahlbrock K. Absolute mRNA quantification using the polymerase chain reaction (PCR). A novel approach by a PCR aided transcript titration assay (PATTY). (англ.) // Nucleic Acids Research. — 1989. — 25 November (vol. 17, no. 22). — P. 9437—9446. — PMID 2479917. [исправить]
  17. ↑ Piétu G., Mariage-Samson R., Fayein N. A., Matingou C., Eveno E., Houlgatte R., Decraene C., Vandenbrouck Y., Tahi F., Devignes M. D., Wirkner U., Ansorge W., Cox D., Nagase T., Nomura N., Auffray C. The Genexpress IMAGE knowledge base of the human brain transcriptome: a prototype integrated resource for functional and computational genomics. (англ.) // Genome Research. — 1999. — February (vol. 9, no. 2). — P. 195—209. — PMID 10022985. [исправить]
  18. ↑ Velculescu V. E., Zhang L., Zhou W., Vogelstein J., Basrai M. A., Bassett Jr. D. E., Hieter P., Vogelstein B., Kinzler K. W. Characterization of the yeast transcriptome. (англ.) // Cell. — 1997. — 24 January (vol. 88, no. 2). — P. 243—251. — PMID 9008165. [исправить]
  19. ↑ 19,0 19,1 19,2 Velculescu V. E., Zhang L., Vogelstein B., Kinzler K. W. Serial analysis of gene expression. (англ.) // Science (New York, N.Y.). — 1995. — 20 October (vol. 270, no. 5235). — P. 484—487. — PMID 7570003. [исправить]
  20. ↑ Audic S., Claverie J. M. The significance of digital gene expression profiles. (англ.) // Genome Research. — 1997. — October (vol. 7, no. 10). — P. 986—995. — PMID 9331369. [исправить]
  21. ↑ 21,0 21,1 21,2 21,3 21,4 21,5 Mantione K. J., Kream R. M., Kuzelova H., Ptacek R., Raboch J., Samuel J. M., Stefano G. B. Comparing bioinformatic gene expression profiling methods: microarray and RNA-Seq. (англ.) // Medical Science Monitor Basic Research. — 2014. — 23 August (vol. 20). — P. 138—142. — PMID 25149683. [исправить]
  22. ↑ Zhao S., Fung-Leung W. P., Bittner A., Ngo K., Liu X. Comparison of RNA-Seq and microarray in transcriptome profiling of activated T cells. (англ.) // PloS One. — 2014. — Vol. 9, no. 1. — P. e78644—78644. — doi:10.1371/journal.pone.0078644. — PMID 24454679. [исправить]
  23. ↑ 23,0 23,1 Hashimshony T., Wagner F., Sher N., Yanai I. CEL-Seq: single-cell RNA-Seq by multiplexed linear amplification. (англ.) // Cell Reports. — 2012. — 27 September (vol. 2, no. 3). — P. 666—673. — doi:10.1016/j.celrep.2012.08.003. — PMID 22939981. [исправить]
  24. ↑ Stears R. L., Getts R. C., Gullans S. R. A novel, sensitive detection system for high-density microarrays using dendrimer technology. (англ.) // Physiological Genomics. — 2000. — 9 August (vol. 3, no. 2). — P. 93—99. — doi:10.1152/physiolgenomics.2000.3.2.93. — PMID 11015604. [исправить]
  25. ↑ 25,0 25,1 25,2 25,3 25,4 25,5 Illumina. RNA-Seq Data Comparison with Gene Expression Microarrays. European Pharmaceutical Review.
  26. ↑ 26,0 26,1 Black M. B., Parks B. B., Pluta L., Chu T. M., Allen B. C., Wolfinger R. D., Thomas R. S. Comparison of microarrays and RNA-seq for gene expression analyses of dose-response experiments. (англ.) // Toxicological Sciences : An Official Journal Of The Society Of Toxicology. — 2014. — February (vol. 137, no. 2). — P. 385—403. — doi:10.1093/toxsci/kft249. — PMID 24194394. [исправить]
  27. ↑ Marioni J. C., Mason C. E., Mane S. M., Stephens M., Gilad Y. RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays. (англ.) // Genome Research. — 2008. — September (vol. 18, no. 9). — P. 1509—1517. — doi:10.1101/gr.079558.108. — PMID 18550803. [исправить]
  28. ↑ SEQC/MAQC-III Consortium. A comprehensive assessment of RNA-seq accuracy, reproducibility and information content by the Sequencing Quality Control Consortium. (англ.) // Nature Biotechnology. — 2014. — September (vol. 32, no. 9). — P. 903—914. — doi:10.1038/nbt.2957. — PMID 25150838. [исправить]
  29. ↑ Chen J. J., Hsueh H. M., Delongchamp R. R., Lin C. J., Tsai C. A. Reproducibility of microarray data: a further analysis of microarray quality control (MAQC) data. (англ.) // BMC Bioinformatics. — 2007. — 25 October (vol. 8). — P. 412—412. — doi:10.1186/1471-2105-8-412. — PMID 17961233. [исправить]
  30. ↑ Larkin J. E., Frank B. C., Gavras H., Sultana R., Quackenbush J. Independence and reproducibility across microarray platforms. (англ.) // Nature Methods. — 2005. — May (vol. 2, no. 5). — P. 337—344. — doi:10.1038/nmeth757. — PMID 15846360. [исправить]
  31. ↑ 31,0 31,1 Nelson N. J. Microarrays have arrived: gene expression tool matures. (англ.) // Journal Of The National Cancer Institute. — 2001. — 4 April (vol. 93, no. 7). — P. 492—494. — PMID 11287436. [исправить]
  32. ↑ Schena M., Shalon D., Davis R. W., Brown P. O. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. (англ.) // Science (New York, N.Y.). — 1995. — Vol. 270, no. 5235. — P. 467—470. — PMID 7569999. [исправить]
  33. ↑ 33,0 33,1 Pozhitkov A. E., Tautz D., Noble P. A. Oligonucleotide microarrays: widely applied--poorly understood. (англ.) // Briefings In Functional Genomics & Proteomics. — 2007. — June (vol. 6, no. 2). — P. 141—148. — doi:10.1093/bfgp/elm014. — PMID 17644526. [исправить]
  34. ↑ 34,0 34,1 34,2 Heller M. J. DNA microarray technology: devices, systems, and applications. (англ.) // Annual Review Of Biomedical Engineering. — 2002. — Vol. 4. — P. 129—153. — doi:10.1146/annurev.bioeng.4.020702.153438. — PMID 12117754. [исправить]
  35. ↑ McLachlan, Geoffrey J.; Do, Kim-Anh[англ.]; Ambroise, Christopher. Analyzing Microarray Gene Expression Data (англ.). — Hoboken: John Wiley & Sons, 2005. — ISBN 978-0-471-72612-8.
  36. ↑ Brenner S., Johnson M., Bridgham J., Golda G., Lloyd D. H., Johnson D., Luo S., McCurdy S., Foy M., Ewan M., Roth R., George D., Eletr S., Albrecht G., Vermaas E., Williams S. R., Moon K., Burcham T., Pallas M., DuBridge R. B., Kirchner J., Fearon K., Mao J., Corcoran K. Gene expression analysis by massively parallel signature sequencing (MPSS) on microbead arrays. (англ.) // Nature Biotechnology. — 2000. — June (vol. 18, no. 6). — P. 630—634. — doi:10.1038/76469. — PMID 10835600. [исправить]
  37. ↑ Meyers B. C., Vu T. H., Tej S. S., Ghazal H., Matvienko M., Agrawal V., Ning J., Haudenschild C. D. Analysis of the transcriptional complexity of Arabidopsis thaliana by massively parallel signature sequencing. (англ.) // Nature Biotechnology. — 2004. — August (vol. 22, no. 8). — P. 1006—1011. — doi:10.1038/nbt992. — PMID 15247925. [исправить]
  38. ↑ 38,0 38,1 PMID 17010196 (PMID 17010196)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  39. ↑ PMID 18516045 (PMID 18516045)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  40. ↑ PMID 18488015 (PMID 18488015)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  41. ↑ 41,0 41,1 PMID 2440339 (PMID 2440339)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  42. ↑ 42,0 42,1 PMID 17406285 (PMID 17406285)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  43. ↑ PMID 1699561 (PMID 1699561)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  44. ↑ PMID 9664454 (PMID 9664454)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  45. ↑ PMID 24888378 (PMID 24888378)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  46. ↑ PMID 15020760 (PMID 15020760)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  47. ↑ 47,0 47,1 47,2 47,3 47,4 PMID 28545146 (PMID 28545146)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  48. ↑ 48,0 48,1 PMID 14663149 (PMID 14663149)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  49. ↑ PMID 24479125 (PMID 24479125)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  50. ↑ 50,0 50,1 PMID 17095434 (PMID 17095434)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  51. ↑ PMID 15978318 (PMID 15978318)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  52. ↑ PMID 8796352 (PMID 8796352)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  53. ↑ PMID 9634850 (PMID 9634850)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  54. ↑ PMID 12582260 (PMID 12582260)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  55. ↑ PMID 16075461 (PMID 16075461)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  56. ↑ PMID 29494575 (PMID 29494575)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  57. ↑ doi:10.1126/science.opms.p1500095
    Вы можете подставить цитату вручную или с помощью бота.
  58. ↑ 58,0 58,1 PMID 18451266 (PMID 18451266)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  59. ↑ PMID 25633159 (PMID 25633159)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  60. ↑ PMID 24578530 (PMID 24578530)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  61. ↑ 61,0 61,1 PMID 18846087 (PMID 18846087)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  62. ↑ PMID 24981968 (PMID 24981968)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  63. ↑ 63,0 63,1 PMID 22140562 (PMID 22140562)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  64. ↑ PMID 26116762 (PMID 26116762)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  65. ↑ PMID 27156886 (PMID 27156886)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  66. ↑ PMID 25649271 (PMID 25649271)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  67. ↑ PMID 21816910 (PMID 21816910)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  68. ↑ PMID 22101854 (PMID 22101854)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  69. ↑ PMID 19349980 (PMID 19349980)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  70. ↑ PMID 24363023 (PMID 24363023)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  71. ↑ PMID 24531970 (PMID 24531970)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  72. ↑ PMID 20711195 (PMID 20711195)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  73. ↑ PMID 22827831 (PMID 22827831)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  74. ↑ 74,0 74,1 PMID 22829749 (PMID 22829749)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  75. ↑ SRA. Дата обращения: 6 октября 2016.
  76. ↑ PMID 22522955 (PMID 22522955)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  77. ↑ PMID 27184599 (PMID 27184599)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  78. ↑ PMID 29334379 (PMID 29334379)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  79. ↑ PMID 26076426 (PMID 26076426)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  80. ↑ PMID 19776739 (PMID 19776739)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  81. ↑ 81,0 81,1 PMID 23961961 (PMID 23961961)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  82. ↑ 82,0 82,1 82,2 PMID 26813401 (PMID 26813401)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  83. ↑ PMID 24020486 (PMID 24020486)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  84. ↑ PMID 22955616 (PMID 22955616)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  85. ↑ PMID 26527727 (PMID 26527727)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  86. ↑ ENCODE: Encyclopedia of DNA Elements. encodeproject.org.
  87. ↑ 87,0 87,1 PMID 25605792 (PMID 25605792)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  88. ↑ 88,0 88,1 PMID 19910308 (PMID 19910308)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  89. ↑ 89,0 89,1 PMID 25633503 (PMID 25633503)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  90. ↑ Smyth, G. K. Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor (англ.). — Springer, New York, NY, 2005. — P. 397—420. — (Statistics for Biology and Health). — ISBN 9780387251462. — doi:10.1007/0-387-29362-0_23.
  91. ↑ Steve., Russell. Microarray Technology in Practice (неопр.). — Burlington: Elsevier, 2008. — ISBN 9780080919768.
  92. ↑ 92,0 92,1 PMID 23845962 (PMID 23845962)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  93. ↑ 93,0 93,1 PMID 25690850 (PMID 25690850)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  94. ↑ PMID 22009675 (PMID 22009675)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  95. ↑ 95,0 95,1 PMID 11752295 (PMID 11752295)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  96. ↑ 96,0 96,1 doi:10.1023/B:VLSI.0000042488.08307.ad
    Вы можете подставить цитату вручную или с помощью бота.
  97. ↑ Kwon, Young Min; Ricke, Steven. High-Throughput Next Generation Sequencing (англ.). — SpringerLink. — doi:10.1007/978-1-61779-089-8.
  98. ↑ PMID 21576222 (PMID 21576222)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  99. ↑ PMID 23481128 (PMID 23481128)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  100. ↑ FastQC: A Quality Control tool for High Throughput Sequence Data. Babraham Bioinformatics. Дата обращения: 23 мая 2017.
  101. ↑ PMID 25408143 (PMID 25408143)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  102. ↑ 102,0 102,1 102,2 PMID 23222703 (PMID 23222703)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  103. ↑ 103,0 103,1 PMID 24532719 (PMID 24532719)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  104. ↑ PMID 23060614 (PMID 23060614)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  105. ↑ PMID 19289445 (PMID 19289445)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  106. ↑ 106,0 106,1 PMID 20436464 (PMID 20436464)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  107. ↑ PMID 20211242 (PMID 20211242)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  108. ↑ PMID 23837739 (PMID 23837739)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  109. ↑ PMID 27252236 (PMID 27252236)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  110. ↑ PMID 25608678 (PMID 25608678)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  111. ↑ PMID 18349386 (PMID 18349386)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  112. ↑ PMID 22368243 (PMID 22368243)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  113. ↑ PMID 20935650 (PMID 20935650)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  114. ↑ 114,0 114,1 PMID 21572440 (PMID 21572440)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  115. ↑ PMID 15140833 (PMID 15140833)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  116. ↑ PMID 16056220 (PMID 16056220)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  117. ↑ PMID 20950480 (PMID 20950480)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  118. ↑ PMID 22506599 (PMID 22506599 )
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  119. ↑ PMID 21816040 (PMID 21816040 )
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  120. ↑ PMID 20195258 (PMID 20195258)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  121. ↑ PMID 25260700 (PMID 25260700)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  122. ↑ PMID 27043002 (PMID 27043002)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  123. ↑ PMID 19505943 (PMID 19505943)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  124. ↑ PMID 25516281 (PMID 25516281)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  125. ↑ PMID 25748911 (PMID 25748911)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  126. ↑ PMID 21498551 (PMID 21498551)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  127. ↑ PMID 20011106 (PMID 20011106)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  128. ↑ PMID 12184808 (PMID 12184808)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  129. ↑ PMID 19056941 (PMID 19056941)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  130. ↑ PMID 20368969 (PMID 20368969)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  131. ↑ 131,0 131,1 PMID 19224247 (PMID 19224247)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  132. ↑ PMID 22739340 (PMID 22739340)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  133. ↑ PMID 26781813 (PMID 26781813)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  134. ↑ PMID 17363976 (PMID 17363976)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  135. ↑ PMID 26551575 (PMID 26551575)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  136. ↑ 136,0 136,1 PMID 26996076 (PMID 26996076)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  137. ↑ PMID 18284925 (PMID 18284925)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  138. ↑ PMID 25517437 (PMID 25517437)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  139. ↑ PMID 22890146 (PMID 22890146)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  140. ↑ PMID 25914674 (PMID 25914674)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  141. ↑ 141,0 141,1 PMID 26759178 (PMID 26759178)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  142. ↑ PMID 15075282 (PMID 15075282)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  143. ↑ PMID 19666593 (PMID 19666593)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  144. ↑ PMID 25502316 (PMID 25502316)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  145. ↑ PMID 19192189 (PMID 19192189)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  146. ↑ PMID 22047402 (PMID 22047402)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  147. ↑ PMID 25214207 (PMID 25214207)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  148. ↑ PMID 23445355 (PMID 23445355)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  149. ↑ PMID 26772543 (PMID 26772543)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  150. ↑ PMID 1883196 (PMID 1883196)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  151. ↑ PMID 16943439 (PMID 16943439)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  152. ↑ PMID 16357227 (PMID 16357227)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  153. ↑ PMID 15851066 (PMID 15851066)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  154. ↑ PMID 22094949 (PMID 22094949)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  155. ↑ Gene Expression Omnibus. www.ncbi.nlm.nih.gov. Дата обращения: 26 марта 2018.
  156. ↑ 156,0 156,1 PMID 11726920 (PMID 11726920)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  157. ↑ 157,0 157,1 PMID 19484163 (PMID 19484163)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  158. ↑ PMID 25361974 (PMID 25361974)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  159. ↑ PMID 26481351 (PMID 26481351)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  160. ↑ PMID 19956698 (PMID 19956698)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  161. ↑ PMID 18835852 (PMID 18835852)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  162. ↑ PMID 26586799 (PMID 26586799)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
Источник — https://megawiki.ru/wiki/Транскриптомные_технологии